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kai1 2fcd82胞外结构域小环在抑制肿瘤转移中的作用及调控机制的

时间:2019-07-23来源:未知 作者:admin点击:
kai1 2fcd82胞外构造域小环正在压迫肿瘤变更中的功用及调控机制的的筹议论文 中图分类号密级 KAll/CD82胞外构造域小环正在压迫肿瘤变更中的功用及调控 机制的筹议 Preliminary study KAll/CD82small extrace

  kai1 2fcd82胞外构造域小环正在压迫肿瘤变更中的功用及调控机制的的筹议论文

  中图分类号密级 KAll/CD82胞外构造域小环正在压迫肿瘤变更中的功用及调控 机制的筹议 Preliminary study KAll/CD82small extracellular loop tumormetastasis 计:学位论文:58页 外格: 指挥教练:马克里教师申请学位级别:硕士学位 学科(专业):生物化学与分子生物学 培育单元:大连医科大学 落成功夫:二O一四年蒲月 答辩委员会主席: 独创性声明 自己端庄声明:所呈交的学位论文是自己正在指挥教练指挥下举办 的筹议事务及所获得的筹议劳绩。除了文中异常加以标注和叩谢的地 方外,论文中不包括其他人曾经宣布或撰写过的筹议劳绩,也不包括 为得回大连医科大学或其它指导机构的学位或证书而行使过的资料。 与我一同事务的同志对本筹议所做的任何奉献均己正在论文中作了精确 的注解并流露谢意。 学位论文作家具名: 具名日期: 年月日 闭于学位论文行使授权的注解 本学位论文作家全体通晓学校相闭保存、行使学位论文的规章,许诺学校保 留并向邦度相闭部分或机构送交论文的复印件和电子版,允诺论文被查阅和借阅。 自己授权大连医科大学能够将本学位论文的总计或部门实质编入相闭数据库举办 检索,能够采用影印、缩印或扫描等复制方法保全和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请正在以下相应方框内打“4”): 1.保密口,正在一年解密后实用本授权书。 2.不保密口。 作家具名: 导师具名: Et期: 年月日日期: 年月日 目次一、摘要…………………………………………………………………1 (一)中文摘要…………………………………………………………l (二)英文摘要…………………………………………………………3 二、正文…………………………………………………………………6 绪言……………………………………………………………………66 第一部门KAll/CD82.SEL寡肽对肿瘤细胞体外侵袭和迁徙的影响(一)资料与要领………………………………………………………8 1.尝试资料……………………………………………………8 1.1 尝试细胞…………………………………………………8 1.2重要试剂…………………………………………………8 1.3重要仪器…………………………………………………8 1.4相干溶液配制……………………………………………9 2.尝试要领……………………………………………………9 2.1 KAll/CD82.SEL寡肽的合成…………………………9 2.2细胞培育…………………………………………………9 2.3体外迁徙尝试…………………………………………lO (二)结果……………………………………………………………1l 1.KAll/CD82.SEL对EGF刺激的SW620细胞迁徙和浸润能 力的影响……………………………………………………1 2.KAll/CD82.SEL对EGF刺激的MDA.MB.231细胞运动和 迁徙才干的影响……………………………………………14 (三)道论……………………………………………………………16 (四)结论……………………………………………………………17 第二部门KAll/CD82.SEL寡肽压迫肿瘤细胞体外迁徙分子机制的 筹议 (一)资料与要领……………………………………………………18 1.尝试资料……………………………………………………18 1.1尝试细胞………………………………………………18 1.2重要试剂………………………………………………18 1.3重要仪器………………………………………………19 1.4相干溶液配制…………………………………………19 2.尝试要领……………………………………………………20 2.1细胞培育………………………………………………20 2.2免疫印迹要领检测……………………………………21 (二)结果………………………………..………………………….23 1.KAll/CD82.SEL寡肽对SW620和MDA.MB.23 1细胞 EGFR磷酸化的影响……………………………………23 2.KAll/CD82.SEL寡肽对EGFR介导的细胞内信号转导通途 活性的影响………………………………………………24 (三)道论……………………………………………………………25 (四)结论……………………………………………………………26 第三部门KAll/CD82.SEL寡肽与KAll/CD82完备分子对SW620细 胞运动性和迁徙才干的影响及分子机制的斗劲筹议 (一)资料与要领……………………………………………………27 1.尝试资料……………………………………………………27 1.1尝试细胞、质粒及菌种…………………………………27 1.2重要试剂………………………………………………27 1.3重要仪器………………………………………………28 2.尝试要领……………………………………………………28 2.1细胞培育………………………………………………28 2.2 pcDNA4/V5.A/CD82质粒的制备……………………29 2.3 pcDNA4/V5一A/CD82质粒的转染…………………30 2.4 SW620细胞中pcDNA4/V5-A/CD82质粒外杀青果的检 测………………………………………………………31 2.5体外迁徙尝试…………………………………………32 2.6免疫印迹要领检测……………………………………32 (二)结果……………………………………………………………33 1.pcDNA4/V5.A/CD82质粒的外杀青果……………………33 2.KAll/CD82.SEL及KAll/CD82完备分子对SW620细胞体 外运动和迁徙才干的影响斗劲……………………………33 3.KAll/CD82.SEL及KAll/CD82完备分子对SW620细胞 EGFR磷酸化的影响斗劲………………………………36 4.KAll/CD82.SEL及KAll/CD82完备分子对EGF介导的肿 瘤细胞内信号通途活性的影响斗劲………………………37 (三)道论……………………………………………………………38 (四)结论……………………………………………………………39 (五)参考文献……………………………………………………...40 三、综述…………………………………………………………………44 (一)综述……………………………………………………………44 (二)参考文献………………………………………………………52 四、攻读学位时代宣布著作境况………………………………………57 五、叩谢………………………………………………………………..58 大连医科大学硕士学位论文 KAll/CD82胞外构造域小环正在压迫肿瘤变更中的功用及调控 机制的筹议 硕士筹议生:张巧姝 指挥教练 :马克里教师 专业名称 :生物化学与分子生物学 摘要 CD82(KAll)属于四跨膜卵白家族(tetraspanin superfamily)的首要成员之 一。其重要生物学效力是参预细胞运动、迁徙的调理。KAll/CD82通俗外达于各 种平常的构制细胞,正在肿瘤构制中外达消重或不外达。最初筹议发明KAll/CD82 是前线腺癌特异的变更压迫因子。厥后大宗的尝试结果注脚,其正在种种区别构制 开头的肿瘤中均有外达。于是,KAll/CD82被以为是广谱的肿瘤变更压迫因子。 KAll/CD82的肿瘤变更压迫才干于1995年被初度报道,但其周密功用机理尚 不全体领会。阐明KAll/CD82的肿瘤变更压迫机制,最先要弄领会KAll/CD82变更 压迫功用的分子构造根底。已知KAll/CD82的分子构造由胞外区、跨膜区和胞内 区三部门构成。胞外区变成一个小环(small extracellular loop,SEL)和一个大环 (1arge extracellular loop,LEL)。跨膜区为四个疏水的肽段;胞内区包含N一端、C一 端和一个细胞内环。目前,相闭KAll/CD82分子的胞外区大环构造、跨膜区和胞 内区效力的筹议良众。KAll/CD82胞外区大环(CD82.LEL)的效力重要是参预 KAll/CD82的二聚化以及与其它膜卵白的互相功用;跨膜区的几个极性氨基酸通 过与其它四跨膜家族卵白女HCD9、CD81等互相功用变成众聚体;胞内区氨基酸残 基的脂酰化有利于KAll/CD82 N一端和c一轨则在膜上的锚定并参预KAll/CD82与其它 四跨膜家族卵白的互相功用。但相闭KAll/CD82胞外区小环(KAll/CD82一SEL) 效力的筹议及报导很少,其功用尚不领会。 正在本论文中,为筹议KAll/CD82.SEL正在KAll/CD82压迫肿瘤变更中的功用, 咱们采用化学合成的要领合成了K_A11/CD82一SEL肽段,采用划痕法、化学趋化技 术对其体外细胞迁徙压迫功用举办了阅览, 同时采用免疫印迹时间对其迁徙压迫 功用的分子机制举办了发轫筹议。并对KAll/CD82一SEL寡肽和完备KAll/CD82分 大连医科大学硕士学位论文 子的运动压迫才干和功用机制举办了发轫的斗劲明白。该课题的筹议,对阐明 KAll/CD82压迫肿瘤变更的分子机理,研制抗变更药物,具有相当首要的外面意 义和潜正在的行使前景。 结果:(1)KAll/CD82.SEL可压迫SW620细胞和MDA—MB一231细胞体外侵袭 及迁徙。其压迫才干随KAll/CD82.SEL浓度升高而巩固。正在5099/mL浓度时,SW620 细胞体外迁徙全体被压迫(P<0.001);正在8099/mlL浓度时,MDA.MB.231细胞体 外迁徙全体被压迫(P<O.001)。(2)KAll/CD82.SEL对EGFR及其相干信号通途的 影响:KAll/CD82.SEL可明显压迫Sw620细胞EGFR的1173酪氨酸位点及Akt473丝 氨酸位点的磷酸化(P<0.001);且可明显抑常IJMDA.MB.231细胞EGFR的1173酪氨 酸位点、845酪氨酸位点、及Akt473丝氨酸位点的磷酸化秤谌(P<0.001)。(3)人 高变更结肠癌细胞SW620转染KAll/CD82过外达质粒后,可消重SW620细胞的转 移才干,但其压迫成果明明低于KAll/CD82一SEL的压迫成果(P<0.001)。通过对 二者机制的筹议发明,正在SW620细胞中,KAll/CD82一SEL可明显抑常I]EGFRl 173酪 氨酸位点及Akt473丝氨酸位点的磷酸化秤谌(P<0.001),而KAll/CD82完备分子 则可能抑f骨IJEGFRl045酪氨酸位点及ERK的磷酸化秤谌(P<0.001)。以上结果注解, KAIl/CD82.SEL肽段和KAll/CD82完备分子的功用机制不全体肖似。 结论:(1)KAll/CD82.SEL寡肽对众种构制开头的肿瘤细胞,包含人高变更 结肠癌SW620细胞和人高变更乳腺癌MDA.MB一231细胞运动迁徙才干均有剧烈的 压迫功用。(2)KAll/CD82.SEL寡肽抑I]sw620细胞和MDA—MB一23 l细胞运动迁 移的机理也许通过压迫EGFR的本身磷酸化及下调细胞内P13K/Akt信号转导通途 告终。但对区别开头的肿瘤细胞,其功用机制不全体肖似。(3)KAll/CD82.SEL 肽段的压迫功用高于KAIl/CD82完备分子,且二者的功用机制区别。 环节词:四跨膜卵白KAII/CD¥2肿瘤变更外皮孕育因子受体P13K/AKT 大连医科大学硕士学位论文 Preliminary study KAll/CD82small extracellular loop tumormetastasis Master Degree candidate:Qiaoshu Zhang Supervisor:Prof.Keli Ma Major:Biochemistry MolecularBiology Abstract KAll/CD82 importantmembers tetraspaninsuperfamily which participates awidevariety biologicalevents aStulllor migration widelyexpressed normaltissues,at sametime,it appears adown regulation KAll/CD82expression tumortissues KAII/CD82 WaS initially identified aspecificmetastasis suppressor prostatecancer,a plethora evidencesupports awide-spectrum invasion- metastasis—suppressorafter solidtumors. Since KAll/CD82 firstreported its ability inhibittumor metastasis 1995,its mechanism graduallybeing revealed,but detailedmechanism how worksremains unclear.The molecular structural bases KAll/CD82should figuredout clarifyits functional mechanism。澳门金沙It has been reported KAll/CD82protein consists membrane-spanningdomains,extracellular domains intracellulardomains.The extraeellular domains contains asmall extracellular loop(SEL)and alarge extracellular loop(LEL);the transmembrane(TM)domains fourhydrophobic peptides,and intracellulardomains comprise aN—terminal tail,a C-terminal cytoplasmic domain aintracellularloop(IL).There plenty KAll/CD82一LEL.TMdomains intraeellulardomains.KAll/CD82一LEL takes part somemembrane proteins.The polar residues TMdomains othertetraspanin superfamily proteins CD9,CD81and form polymer themThe aeylation intraeellulardomains likely assists 大连医科大学硕士学位论文C.terminal interactionsbetween TM domains TetraspaninWeb.Howeverthe function rarelyreported wellunderstood. To duddate tumormetastasis,we synthesized chemicalsynthesis observeits inhibitory activity cellmigration vitrothrough scratching chemotactic ways.Meanwhile,we made aprimary research molecularmechanism whichKAll/CD82一SEL affect cellmotility through immunoblotting.What’S more,a initiatory comparison between KAll/CD82.SEL KAll/CD82whole molecular conducted.Theresearch provides aessential theoretical significance potentialapplications whichKAll/CD82 suppresses tumor metastasis anti—metastaticdrugs. Resets:(1)CD82一SEL can significantly inhibit MDA-MB一231cells migration providesapositive correlation between actionconcentration itssuppression.The SW620 231cells Can respectively completelyinhibited 5099/ml(P<0.001)and80pg/ml(P<0.001).(2)Impact ofKAll/CD82 SEL relativesignaling pathway:in SW620 cells,the phosphorylation level Akt—Ser-473Can remarkablyinhibited fP<0.001);in MDA MB一23 1cells,the phosphorylation level EGFR—Tyr-845,EGFR—Tyr-1173 Akt—Ser-473can remarkablyinhibited(P<O.001).(3)Over-expression plasmid highlymetastatic human colon cancer SW620,and its inhibition ability lowerthan KAll/CD82.SEL(P<O.001).Through bothmechanisms, we found SW620cells,the phosphorylation level EGFRTyr-l 173 Akt.Ser-473Can remarkablyinhibited(P<0.001)under KAll/CD82--SEL;thephosphorylation level EGFR-Tyr-1045 ERKcan remarkablyinhibited(P<O.00 1)under KAI1/CD82 whole molecular(P< 0.001). Conclusions:(1)KAll/CD82-SEL shows aintense inhibition 大连医科大学硕士学位论文tumor cells derived from various tissues,including SW620 MDA-MB一231.(2)The mechanism how KAll/CD82- SEL inhibits MB-23 1cells shares acell differentiation.(3)The inhibition efficiency KAll/CD82一SELpeptide fragment higherthan KAll/CD82whole molecularand actioniS different. Keywords:KAll/CD82 Tetraspanin Tumor metastasis EGFR P13K/Akt 大连医科大学硕士学位论文KAll/CD82胞外构造域小环正在压迫肿瘤变更中的功用及调控 机制的筹议 硕士生姓名:张巧姝 指挥教练:马克里教师 专业名称:生物化学与分子生物学 绪言 浸润和变更是肿瘤繁荣的明显特性,也是导致患者不行取得有用疗养而爆发 灭亡的重要缘由。肿瘤的变更是由肿瘤原发灶直接向方圆构制扩张,或者通过血 道、淋巴道变更的肿瘤细胞正在远方构制落户变成再生肿瘤的流程。纵然是肿瘤的 早期也也许存正在远方变更。于是,弄领会肿瘤爆发变更的机制及其影响身分已成 为改正肿瘤患者预后的环节。 KAll/CD82是四跨膜卵白家族(tetraspanin superfamily)的首要成员之一n1。其 重要生物学效力是参预细胞运动、迁徙的调理心]。KAll/CD82通俗外达于种种正 常的构制细胞,正在肿瘤构制中外达消重或不外达。最初筹议发明KAll/CD82是前 列腺癌特异的变更压迫因子1。厥后大宗的尝试结果注脚,正在种种区别构制开头 的肿瘤中,KAII/CD82均可压迫细胞变更[4-63。于是,KAll/CD82被以为是广谱的 肿瘤变更压迫因子(wide—spectrum invasion.and metastasis—suppressor)。KAll/CD82 可压迫体外培育肿瘤细胞的运动迁徙才干,亦可压迫动物模子肿瘤细胞的变更H1, 临床上众种肿瘤的恶性水平及变更才干(越发是淋巴道变更才干)与l认11/CD82 卵白的外杀青负相干口11,检测KAll/CD82卵白的外达可做为鉴定肿瘤是否变更及 预后的首要目标口…”3。 自从1995年KAll/CD82的肿瘤变更压迫才干被初度报道从此,良众学者对其 压迫肿瘤浸润和变更的机制举办了不息的寻求,其压迫变更的机制正慢慢被揭示。 KAll/CD82压迫肿瘤细胞的变更重要通过两条途经来告终。一是直接压迫细胞的 浸润及运动迁徙才干。KAll/CD82能够直接与极少细胞外外黏附分子如整合素 (integfin)、膜连合型免疫球卵白(mIgG)均分子互相功用,影响细胞与细胞外基质分 子的识别黏附,从而调理细胞的浸润、运动和迁徙n 2’13]。二是直接或间接功用于 大连医科大学硕上学位论文 极少细胞质膜受体如孕育因子受体等,影响其介导的信号跨膜传达,从而调理细 胞内与运动迁徙相干的信号通途14-18]o进一步的深刻筹议发明,KAll/CD82生物 学效力的外现有赖于细胞膜特定构造四跨膜卵白汇集(Tetraspanin Web)的变成。正在 细胞外外,CD82/KAll常与孕育因子受体、 integrins、神经节甘脂GM2和GM3以 及其它四跨膜卵白家族的成员女ICD9、CD81等簇集正在沿途变成特定的效力微区。 抑带lJTetraspanin w曲的变成,KAll/CD82将遗失变更压迫的才干…。正在Tetraspanin Web中,KAIl/CD82何如与其它组分互相识别、连合,其分子构造根底是什么仍不 领会。于是,阐明KAll/CD82功用的分子机制,必需弄领会KAll/CD82分子区别结 构域正在KAll/CD82压迫肿瘤变更中的功用。 己知KAll/CD82的分子构造由胞外区、跨膜区和胞内区三部门构成。胞外区 变成一个小环(small exlracellular loop,SEL)和一个大环(1arge extracellular loop,LEL) 口9|。跨膜区为四个疏水的肽段。个中l、3、4肽段各含一个亲水氨基酸残基,天冬 酰胺,谷氨酰胺和谷氨酸。胞内区包含N.端、C一端和一个细胞内环。胞内区氨基 酸残基Gly2、Cys5、Cys251币HCys253常爆发脂酰化心““3。对KAll/CD82区别构造 域正在Tetraspanin Web变成中的功用的筹议注脚,KAIl/CD82胞外区大环 (CD82/KAll一LEL)的效力是参预KAll/CD82的二聚化以及与其它膜卵白的互相作 9’22。;跨膜区的几个极性氨基酸通过与其它四跨膜家族卵白O[]CD9、CD81等互相功用变成众聚体H。412“;胞内区氨基酸残基的脂酰化有利于KAll/CD82 N一端和 C.轨则在膜上的锚定并参预KAll/CD82与其它四跨膜家族卵白的互相功用。启今为 至,相闭KAll/CD82胞外区小环(KAll/CD82.SEL)效力的筹议及报导很少,其功用 尚不领会。 为了阐明KAIl/CD82一SEL正在CD82/KAll压迫肿瘤变更中的功用,咱们以人结 肠癌高淋巴道变更SW620细胞和人乳腺癌高淋巴道变更MDA—MB一231细胞为模 型,采用化学法合成CD82/KAll一SEL寡肽,对CD82/KAll一SEL寡肽影响SW620和 MDA.MB.231细胞体外迁徙和侵袭的境况及功用机理举办筹议。 大连医科大学硕士学位论文第一部门 KAll/CD82一SEL寡肽对肿瘤细胞体外 侵袭和迁徙的影晌 为了阐明KAll/CD82.SEL正在CD82/KAll压迫肿瘤变更中的功用,本部门实 验以化学合成的KAll/CD82一SEL寡肽处罚SW620和MDA.MB一23 1细胞,并以分 子量、氨基酸残基肖似的随机氨基酸序列寡肽做比较,采用划痕法和趋化法阅览 了KAll/CD82.SEL寡肽正在体外对两细胞株迁徙和侵袭的影响。 资料与要领 1.尝试资料 1.1尝试细胞 人结肠癌高淋巴道变更细胞株SW620 购于中科院上海细胞库 人乳腺癌高淋巴道变更细胞株MDA-MB.231 购于中科院上海细胞库 1.2重要试剂 Leibovitz’S L-15培育基 北京中科迈晨科技有限公司 优级胎牛血清 天津灏洋生物成品科技有限职守公司 胎牛血清 GIBCO,USA Tryspin—EDTA GIBCO,USA NaCI、Na2HPO。 北京化工场 EGF Genentech,USA Pen Strep GIBCO,USA ISOPORE Membrane Filter Millipore,USA 1.3重要仪器 C02培育箱Thermo,USA 超低温冰箱 SANYO,JAPAN 颠倒显微镜 Olympus,JAPAN 大连医科大学硕士学位论文细胞培育板 CostarUSA 立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗工具厂 离心思80—2型 上海手术工具厂 超净事务台 上海跃进医疗工具厂 电子天平、电子周密天平 北京赛众利斯仪器编制有限公司 石英管加热式自愿双重纯水蒸馏器1810B 上海玻璃仪器厂 恒温水浴箱 北京市医疗兴办厂 荧光显微镜 Olympus,Japan 1.4相干溶液配制 (1)PBS缓冲液(pH7.41:用电子天等分别称取NaCI 8.09,KCl O.29,Na2HP04 1.429,KH2P04 0.279,向烧杯中参预800mL去离子水,搅拌使其全体消融,用lmol/L HCI调理pH至7.4,用去离子水定容至1000mL,4"C保全。 (2)细胞冻存液:L-15培育基70%、优级胎牛血清10%和DMSO 10%,现 配现用。 2.尝试要领 2.1 KAIl/CD82.SEL寡肽的合成 KAll/CD82.SEL寡肽和处罚比较组众肽合成于上海强耀生物科技有限公司。 储存液的配制:用电子周密天平称取KAll/CD82.SEL4.5mg,向个中参预L一15 培育基4mL,用枪头一再奏乐直至其全体消融,分装至Eppendorf管一20。C保全。 处罚比较组储存液配制要领同上。 2.2细胞培育 2.2.1细胞苏醒 (1)将冻存的人结肠癌高淋巴道变更细胞株SW620从液氮中急忙取出,迅 速放入37水浴中轻轻摇晃,使其急迅消融; (2)超净台内将冻存管内液体总计移入离心管中,并向离心管中参预约2mL L.15培育基,1000rpm离心5min汇集细胞; (3)弃上清液,向离心管中参预约5mL含有双抗(Penicillin lOOU/m1. Streptomycin 100vg/mL)、10%胎牛血清的L一15培育基,奏乐平均制成细胞悬液; (4)将细胞悬液总计移入25cm2培育瓶中,置于37。C、5%C02孵箱中培育; 大连医科大学硕士学位论文 (5)苏醒后第二天换液,之后遵照细胞状况每2~3天换液一次,待细胞长至 约90%统一时传代至24一well板中。 人乳腺癌高淋巴道变更细胞株MDA—MB一231操作同上,但更改培育条目为 37、氛围100%。 2.2.2细胞传代 (1)待细胞长至约90%统一时,弃培育基,用PBS轻轻冲洗细胞两次; (2)参预2mL0.25%Tryspin.EDTA,将培育瓶放入培育箱中,2~3min后取出; (3)颠倒显微镜下阅览细胞,轻轻敲击培育瓶底部,当细胞变圆零落时向培 养瓶中参预适量含10%胎牛血清的L.15培育基,一再奏乐使细胞总计零落; (4)用玻璃吸管将培育瓶中细胞悬液总计移入离心管中,1000rpm离心5rain 汇集细胞; (5)弃上清液,参预稀奇的培育基一再奏乐混匀; (6)用移液枪汲取细胞悬液至培育瓶或细胞培育板中培育待用。 2.2.3细胞冻存 (1)汇集处于对数孕育期的细胞,弃培育基,用PBS轻轻冲洗细胞1~2次; (2)Tryspin消化后总计移入离心管中,1000rpm离心5min; (3)弃上清液,向离心管中参预刚配制好的细胞冻存液一再奏乐混匀; (4)汲取细胞悬液向每个冻存管中参预900“L,外明细胞株、日期: (5)冻存管挨次放入4。C30min、.20。C30min、一80止宿,第二天进入液氮 中长远保全。 2.3体外迁徙尝试 细胞体外运动迁徙才干的检测行使划痕尝试及细胞趋化尝试。 2.3.1细胞划痕尝试:尝试细胞举办止宿饥饿后参预含50ng/mL EGF的无血清 培育基举办划痕,并向各孔平分别参预区别浓度梯度的KAll/CD82一SEL(SW620 细胞处罚终浓度辞别为10}tmol/L、20pmol/L、30I.tmol/L、40pmol/L、50I.tmol/L; MDA.MB一231细胞处罚终浓度辞别为20 J.tmol/L、40Bmol/L、601amol/L、80IItmol/L) 和比较短肽(SW620细胞处罚终浓度为50pmoFL;MDA—MB.23 1细胞处罚终浓度 为80pmol/L),空缺比较组细胞不作任何药物处罚。37"C于培育箱中孵育(SW620 细胞孵育功夫为48h,5%C02;MDA—MB一231细胞孵育功夫为24h,100%氛围)。 大连医科大学硕士学位论文 培育完了后,去除培育基并用PBS冲洗细胞,于显微镜下观测细胞迁徙境况。 2.3.2细胞趋化尝试:采用Boyden小室培育法(8.0肛m pore polycarbonate membrane filter)。全体操作如下: (1)汇集用无血清培育基饥饿培育止宿的细胞,用PBS轻轻冲洗细胞2~3 遍,将细胞重悬正在含50ng/mL EGF的无血清L-15培育基中,使细胞悬液终浓度达 x105个/mL,按300pL/孑L的量参预到Boyden上室;(2)正在Boyden下室内参预250pL的含10%胎牛血清的L-15培育基; (3)正在上室内辞别参预区别梯度浓度的KAll/CD82.SEL(SW620细胞处罚终 浓度辞别为10lamol/L、20pmol/L、301maol/L、40J_tmol/L、50rtmol/L:MDA—MB一231 细胞处罚终浓度辞别为20I.tmol/L、40pmol/L、60pmol/L、80pmol/L)和比较短肽 fSW620细胞处罚终浓度为50/.tmol/L:MDA—MB一23 1细胞处罚终浓度为801amol/L), 空缺比较组细胞不作任何药物处罚,37于培育箱中孵育(SW620细胞孵育功夫为 48h,5%C02;MDA—MB一231细胞孵育功夫为24h,100%氛围): (4)取出Boyden小室,用棉签轻轻擦去膜上室面残余细胞,4"C甲醇固定 30mira (5)用0.I%DAPI染色,镜下阅览下室面爆发变更的细胞,每个滤膜反省5 个视野(100x),取其均值计数。 结果 1.KAll/CD82.SEL对EGF刺激的SW620细胞迁徙和浸润才干的影响 以区别浓度的KAll/CD82一SEL寡肽处罚SW620细胞48h,采用划痕法(Fig.1) 和细胞趋化法(Fig.2)阅览了KAll/CD82.SEL寡肽对SW620细胞迁徙的影响。 Fig.1为划痕法尝试结果。图中a为L15培育基比较组,b、C、d、e、f图辞别 为10 J.tmol/L、20I-tmol/L、30I,tmol/L、40pmol/L、509mol/L的KAll/CD82一SEL寡 肽处罚组,g为随机氨基酸序列寡肽比较组。由图可睹,KAll/CD82一SEL寡肽可 明显压迫SW620细胞的体外迁徙才干。其压迫功用随浓度进步而巩固。当 KAll/CD82.SEL寡肽浓度到达50肛mol/L时SW620细胞的迁徙被全体压迫。 Fig.2为细胞趋化法尝试结果。图中a为L15培育基比较组,b、c、d、e、f 11 大连医科大学硕士学位论文 图辞别为10I.tmol/L、20pmol/L、30pmol/L、40p.mol/L、501.tmol/L的KAll/CD82-SEL 寡肽处罚组,g为随机氨基酸序列寡肽比较组。由Fig.2A可睹,KAll/CD82-SEL 寡肽可明显压迫SW620细胞的浸润才干。其压迫功用呈浓度依赖性。当501maol/L 时压迫功用最强,与划痕法结果肖似。 固!bCgFig.1.Effect KAIl/CD82small extracellular loop Oil motility SW620cell stimulated EGFusing scratch analysis a:+EGF b:+EGF+KAll/CD82-SEL(10pmol/L) c:+EGF+KAll/CD82-SEL(20pmol/L) d:+EGF+KAll/CD82-SEL(30pmol/L) e:+EGF.+KAll/CD82一SEL(40pmol/L) f.+EGF+KAll/CD82一SEL(50pmol/L) g:+EGF+random peptide(50pmol/L) The SW620 cells were prepared Methods,andwere allowed 37。Cafter scratchWaS made.Plates were photographed 200xmagnification.All experiments were performed leastthree times. Fig.2B为Fig.2A统计学结果。正在KAll/CD82一SEL五个由低到高剂量的功用下 细胞迁徙的数目辞别为120.78+18.82、103.83+12.22、83.79+6.66、38.119.60、 20.35+4.58,短肽比较组细胞迁徙的数目为130.28+11.02,空缺比较组细胞迁徙的 数目为135.44+17.69。个中30I_tmol/L剂量组和空缺比较组斗劲时,P<0.01; 401xmol/L、50pmol/L剂量组和空缺比较组斗劲时,P<0.001,区别具有统计学意 大连医科大学硕士学位论文 义。而短肽比较组和空缺比较组比拟,P>0.05,区别不具有统计学旨趣。 o.ji.0 200 150 C38100 o50 KAJl/CD82small extracellular loop SW620cell stimulated EGFusing chemo taxis migration assay a:+EGF b:+EGE+KAll,CD82.SEL(10pmol/L) c:+EGF.+KAIl/CD82.SEL(20pmol/L) d:+EGF.+KAll/CD82.SEL(30pmol/L) e:+EGF.+KAll/CD82-SEL(401tmol/L) f.+EGF.+KAIl/CD82-SEL(S01tmol/L) g:+EGF+random peptide(50pmol/L) Chemo taxis migration assay performedusing aBoyden chamber 8liraporepolycarbonate

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